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Analyse Biomolécules

par Jocelyne Gauthier - publié le , mis à jour le

L’équipe « Sciences analytiques » fédère deux sous-équipes en techniques séparatives, spectrométrie de masse et écologie chimique :


TECHNIQUES DE SEPARATIONS BIOANALYTIQUES.

Catherine Perrin (PR, UM1), Marie Dominique Blanchin (MCU, UM1), Gaëlle Coussot (MC, UM1), Y. SORBS (AT, UM1), Huguette Fabre (PR émérite, UM1).

1. Axes de recherche

Les activités de recherche du groupe Techniques de Séparation Bioanalytiques sont pour l’essentiel centrées sur le développement de méthodes d’analyse séparatives pour la caractérisation et le contrôle de biomolécules (peptides, protéines…) d’intérêt pharmaceutique :

Principaux thèmes de recherche développés au cours des 5 dernières années :

  • Etude des recouvrements de capillaires non-covalents en vue d’améliorer l’analyse des peptides et protéines par électrophorèse capillaire.
  • Caractérisation de conjugués polypeptidiques à visée thérapeutique.
  • Développement d’une méthode de caractérisation de supports solides fonctionnalisés avec des groupements amines.
  • Etude de la séparation de dendrimères greffés de la lysine par électrophorèse capillaire de zone.
  • Développement d’une méthodologie analytique pour le contrôle de souches naturelles de composés biologiquement actifs.
  • Analyse chirale (chromatographie, électrophorèse capillaire)
  • Développement d’outils analytiques/chimiométriques pour la caractérisation d’agents de lyse érythrocytaires d’origine végétale ou de synthèse.

2.Projets actuellement développés

Etude des recouvrements de capillaires non-covalents pour l’analyse des peptides et protéines par électrophorèse capillaire.

L’électrophorèse capillaire présente un potentiel remarquable pour l’analyse de peptides et protéines de part les très grandes efficacités de pics obtenues et la possibilité de travailler dans des conditions analytiques très variées. Cependant, d’importants phénomènes d’adsorption de ce type de composés sur les parois en silice des capillaires utilisés pour les séparations conduisent à une détérioration très importante des performances analytiques (non répétabilité des analyses, perte d’efficacité, analyse quantitative erronée….).
Dans ce contexte, nous étudions les performances des recouvrements de capillaires non-covalents utilisant des polyélectrolytes hautement chargés afin de limiter les phénomènes d’adsorption. Les résultats que nous avons obtenus montrent que ce type de recouvrements est extrêmement efficace pour limiter les phénomènes d’adsorption s’ils sont utilisés dans des conditions optimales (concentration en électrolyte, composition des solutions de revêtements, force ionique…) qui ont été déterminées au cours de nos travaux de recherche. Des résultats particulièrement remarquables ont été obtenus en termes de répétabilité et d’efficacité pour l’analyse de peptides et protéines en utilisant notamment des revêtements multicouches et ce dans des conditions d’analyse variées : pH, présence de solvants organiques... De très grandes efficacités (N ˜ 800 000) ont été obtenues lors de l’analyse de protéines. Ces recouvrements sont utilisés dans le cadre d’autres travaux de recherche pour l’analyse de divers types de biomolécules (protéines, conjugués polypeptidiques, peptidomimétiques…) ou polymères de synthèse (polymères de l’acide lactique, dendrimères greffés de la lysine….).

[1] Influence of polyelectrolyte coating conditions on capillary coating stability and separation efficiency in capillary electrophoresis, R. Nehmé, C. Perrin, H. Cottet, M-D. Blanchin, H. Fabre, Electrophoresis, 29 (2008) 3013-3023. (IF : 3.576)
[2] Influence of polyelectrolyte capillary coating conditions on protein analysis in capillary electrophoresis, R. Nehmé, C. Perrin, H. Cottet, M-D. Blanchin, H. Fabre, Electrophoresis, 30 (2009) 1888-1898. (IF : 3.569)
[3] Use of coated capillaries for the electrophoretic separation of stereoisomers of a growth hormone secretagogue, R. Nehme, C. Perrin, V. Guerlavais, J-A. Fehrentz, H. Cottet, J. Martinez, H. Fabre, Electrophoresis, 30 (2009) 3772-3779.
[4] Stability of capillaries coated with highly charged polyelectrolyte mono and multilayers. Application to protein analysis, R. Nehmé, C. Perrin, H. Cottet, M.D. Blanchin, H. Fabre, J. Chromatogr. A, 1218 (2011) 3537-3544
[5] R. Nehmé, C. Perrin, Peptide and protein analysis by capillary electrophoresis : Strategies to prevent adsorption phenomena, in Methods in Molecular Biology, vol. Capillary Electrophoresis of Biomolecules, Humana Press, sous presse (2012).

Développement d’une méthode de caractérisation de supports solides fonctionnalisés avec des groupements amines.

Nous avons développé et validé une méthode colorimétrique originale, appelée ADECA (Amino Density Estimation by Colorimetric Assay), permettant d’évaluer la densité des fonctions amines de surface sur de nombreux formats de supports solides greffés. La méthode ADECA est basée sur l’utilisation d’un agent de coloration, le bleu de Coomassie G-250 (noté CBB). Elle permet un dosage indirect des sites protonés de la surface grâce à la complexation réversible du CBB avec les groupements aminés (N+). La méthode ADECA présente de nombreux avantages par rapport aux méthodes traditionnellement utilisées (microscopie à force atomique, ellipsométrie, marquage des fonctions amines… ) pour la caractérisation de surfaces aminées en terme de flexibilité et de coût mais surtout, elle permet la caractérisation de tout type de support (silicone, verre, polystyrène, polypropylène, polyéthylène, polycarbonate, cyclooléfines.. ) quelle que soit leur géométrie. De plus cette méthode est non destructive, permettant l’utilisation du support après caractérisation.

[1] Colorimetric quantification of amino groups in linear and dendritic structures, G. Coussot, E. Nicol, A. Commeyras, I. Desvignes, R. Pascal, O. Vandenabeele-Trambouze, Polymer International, 58(5) (2009) 511-518
[2] A rapid and reversible colorimetric assay for the characterization of aminated solid surfaces, G. Coussot, C. Perrin, T. Moreau, M. Dobrijevic, A. Le Postollec, O. Vandenabeele-Trambouze. IF=3.3, Analytical & Bioanalytical Chemistry, 399(3) (2011) 1061-1069
[3] Aminated dendritic surfaces characterization : a rapid and versatile colorimetric assay for estimating the amine density and coating stability, G. Coussot, C. Faye, A. Ibrahim, M. Ramonda, M. Dobrijevic, A. Le Postollec, F. Granier, O. Vandenabeele-Trambouze, Analytical & Bioanalytical Chemistry, 399(6) (2011) 2295-2302
[4] Antibody-based surfaces : rapid characterization using two complementary colorimetric assays, T. Moreau, C. Faye, M. Baque, I. Desvignes, G. Coussot, R. Pascal, O. Vandenabeele-Trambouze, Analytica Chimica Acta (2011) 706, 354-360

Développement d’une méthodologie électrophorétique pour le contrôle de souches naturelles de composés biologiquement actifs.

Les sociétés pharmaceutiques développant des médicaments homéopathiques utilisent pour leurs préparations un très grand nombre de souches naturelles (végétales, biologiques, minérales…). Le contrôle qualité des matières premières biologiques entrant dans la composition de médicaments homéopathiques est bien plus complexe que celui des petites molécules pharmaceutiques. En effet, les petites molécules pharmaceutiques sont synthétisées avec un très haut degré de pureté et leur dosage ainsi que le contrôle des impuretés (en faible nombre et en faible quantité) est relativement aisé. A l’inverse, les souches naturelles sont des mélanges extrêmement complexes d’un très grand nombre de composés. De plus, les composés actifs (responsables de l’activité thérapeutique) de la souche ne sont souvent pas identifiés. De fait, aucune technique analytique ne permet de caractériser entièrement une souche d’origine naturelle. De nombreuses analyses très variées (visuelles, sensorielles, mesure de constantes physico-chimiques, teneur en cendre…) sont donc réalisées afin de prouver l’identité et la qualité de la souche.
Afin de s’assurer de l’homogénéité (qualitative et quantitative) de chaque souche reçue, il est également demandé de développer des méthodes de contrôle analytique permettant d’obtenir un « profil analytique » de la souche considérée qui srvira de référence pour le contrôle des lots utilisés en production.
Dans ce contexte, nous travaillons au développement de profils analytiques pour l’identification et le contrôle qualité de différentes souches naturelles utilisées dans des préparations pharmaceutiques. De part la nature de ces souches (milieux complexes composés pour l’essentiel de protéines, certaines présentant une forte activité enzymatique), l’électrophorèse capillaire est apparue comme une technique bien adaptée pour établir une empreinte spécifique.
Les techniques d’électrophorèse capillaire de zone et d’isofocalisation électrique sont étudiées pour le développement des profils analytiques de chaque venin. La validation des empreintes analytiques est réalisée à l’aide de divers lots (production, origine) des souches à caractériser et de souches biologiques proches. Des méthodes chimiométriques sont également utilisées afin d’extraire l’information et assurer une identification univoque des souches.

Développement d’un MicroSystème de Séparation Electrophorétique pour le séquençage, la caractérisation et le contrôle de PolyPeptides fonctionnels.

L’objectif du projet MISSE-PoP est de développer et de valider une méthodologie bio-analytique intracapillaire pour caractériser des polypeptides fonctionnels et effectuer un contrôle qualité rapide de nouvelles préparations pharmaceutiques. Les formulations polypeptidiques actuellement développées sont souvent complexes : elles présentent une grande hétérogénéité, ce qui proscrit leur analyse directe en vue de leur caractérisation. La méthodologie développée dans le cadre de ce projet propose dans un premier temps de réduire la complexité de ce mélange par une ou plusieurs étapes de digestion enzymatiques ; puis dans un deuxième temps, de séparer, identifier et quantifier les différentes fractions obtenues par électrophorèse capillaire (EC) couplée à divers détecteurs (UV, fluorescence induite par laser (LIF), spectrométrie de masse (SM)). Cette méthodologie présente tous les avantages de l’EC : séparation rapide des composés, faible consommation de réactifs (de l’ordre du nanolitre), automatisation de la procédure. L’automatisation la plus complète possible des méthodes d’analyse est un enjeu très important afin de limiter les manipulations et diminuer les temps d’analyse. C’est pourquoi le projet vise à développer une méthodologie de digestion enzymatique automatisée à l’intérieur du capillaire de silice utilisé ensuite pour la séparation du produit de départ et des peptides issus de l’hydrolyse. Les fragments obtenus seront ensuite identifiés et quantifiés pour permettre une caractérisation univoque des polypeptides fonctionnels. Les développements électrophorétiques de ce projet seront transférés sur des microsystèmes de séparation car ils répondent aux mêmes lois de la microfluidique.

Etude comparée des agents de lyse érythrocytaires d’origine végétale ou de synthèse : cas particulier des saponines et des ammoniums quaternaires
Thèse de doctorat – CIFRE an collaboration avec la société Horiba médical

Ce travail de doctorat s’inscrit dans le développement de méthodes automatisées de diagnostic en hématologie. Bien que les agents de lyse érythrocytaires à l’étude et leurs principales caractéristiques soient connus, leur utilisation dans ce type d’applications justifie une recherche approfondie. En effet, des composés chimiques tels que les saponines triterpéniques classiquement utilisées, ne sont pas des composés de synthèse mais des composés extraits d’éléments végétaux dont la disponibilité quantitative et qualitative rencontre sur le moyen terme des variabilités peu compatibles avec une production industrielle de qualité. L’intérêt de ces composés est leur activité spécifique sur la membrane cellulaire des globules rouges. Les sels d’ammonium quaternaires présentent quant à eux une activité lytique générique dont l’étude apparaît indispensable dans l’évolution de future produits dans le domaine de l’hématologie.
Le projet comprend 3 axes principaux :

A1) La réalisation et la valorisation d’une recherche bibliographique concernant les activités de surface et lytique comparées, des 2 familles de composés à étudier.
A2) L’étude des relations structure-activité des propriétés tensio-actives des composés à l’étude par différents procédés analytiques en collaboration avec les plates-formes universitaires spécialisées.
A3) L’analyse des interactions avec les constituants de la membrane du globule rouge pour la modélisation de nos applications.


SPECTROMETRIE DE MASSE.


C. ENJALBAL, S. CANTEL, P. SANCHEZ.

1. Axes de recherche

Les activités de recherche de l’équipe sont centrées sur la spectrométrie de masse de petites molécules organiques, de peptides et de protéines, comprenant à la fois des ‘Développements méthodologiques’ ainsi que des ‘Applications à l’interface chimie-biologie’, faisant intervenir des collaborations avec des équipes de chimistes, de biologistes, de pharmacocinéticiens, de physico-chimistes.

En s’appuyant sur l’expertise de l’équipe en analyse à haut débit (petites molécules et macromolécules polymériques), en chimie des peptides, en imagerie pour la cartographie moléculaire de surfaces et en marquage isotopique à des fins de dosage en milieux biologiques, les projets de recherche en cours concernent d’une part, le développement d’outils analytiques innovants en peptidomique et protéomique, et d’autre part l’étude d’interaction protéine/ligand par diverses techniques de spectrométrie de masse.

Par ailleurs, l’équipe assure le contrôle analytique des petites molécules organiques et des biomolécules, notamment des peptides, des protéines, et des polymères synthétiques, tant du point de vue de l’identification que du dosage (plate-forme analytique de l’IBMM) et participe au développement des techniques analytiques en spectrométrie de masse au sein de l’Institut (Plateau technique, Laboratoire de Mesures Physiques).

2.Projets actuellement développés

1 Développement de nouveaux outils de spectrométrie de masse pour l’analyse de peptides en peptidomique/protéomique :

  • Séquençage peptidique : Etude des fragmentations basse et haute énergies avec divers configurations d’analyseurs (Q/Tof, Tof/Tof)

  • LDI-MS sur supports inertes pour l’analyse robuste sensible à haut débit de digestats protéiques : Des poudres amorphes aux surfaces nanostructurées


  • Stratégie novatrice pour l’étude du sulfoproteome par MALDI-MS
    Etiquetage chimique non-covalent sélectif de résidus tyrosine présentant une modification post-traductionnelle (MPT) de type sulfatation


2) Etude de protéines par spectrométrie de masse :

  • Détection et quantification de biomarqueurs de protéines en milieu complexe par ciblage de peptides spécifiques

  • Interaction Protéine/Ligand : Criblage de fragments par spectrométrie de masse selon une approche de type “Fragment Based Drud Design”

Analyse à haut débit en chimie automatisée

Les molécules organiques, et plus particulièrement les biomolécules, sont synthétisées selon diverses stratégies : en solution (phase homogène) ou sur support (phase hétérogène) incluant phase solide (molécules en croissance sur un matériau insoluble) et phase liquide (molécules en croissance sur un support polymérique à solubilité variable). Toutes ces approches synthétiques, dans leurs versions automatisées, permettent la production rapide de collections de composés isolés ou en mélange (chimie combinatoire). Il est alors impératif de réaliser l’indispensable contrôle analytique également en mode haut débit. Quelles que soient les stratégies de synthèse utilisées, les produits sont décrochés du support en fin de synthèse et analysés en solution (Cleave and Analyze). Les techniques d’ionisation à pression atmosphérique telle que l’Electrospray et l’APCI couplées à des systèmes de chromatographie liquide en mode analytique et en mode préparatif permettent l’analyse et la purification de chimiothèques à haut débit. La spectrométrie de masse est utilisée afin de mettre en œuvre des analyses de contrôle qualité des échantillons synthétisés en procédures automatisées (molécules organiques, dérivés d’aminoacides, peptides, pseudopeptides, ..)

Appareillages :
LC/MS analytique (ZQ,Waters), LC/MS préparative (Système Autopurification, Waters), LC/MS/MS avec configuration QqQ (Quatro Micro, Waters) et QqTof (QTof 1, Waters).

Collaborations :
M. Amblard, G. Subra et N. Masurier de l’équipe 9 de l’IBMM « Chimie des Acides Aminés, Peptides, Hétérocycles, Chimie Supportée ».

Publications :
[1] J-L. Aubagnac, C. Drouot, C. Enjalbal, P. Fulcrand, J. Martinez, Annales de Quimica Int. Ed., 1998, 94, 262-268, Monitoring of peptides libraries by Fast Atom Bombardment and Electrospray Ionization mass spectrometry.
[2] J-L. Aubagnac, M. Amblard, C. Enjalbal, G. Subra, J. Martinez, P. Durand, P. Renaut, Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening, 1999, 2, 289-296, Identification of synthetic by-products in combinatorial libraries using high performance liquid chromatography - electrospray ionization mass spectrometry.
[3] C. Enjalbal, J. Martinez, J-L. Aubagnac, Mass Spectrom. Rev., 2000, 19, 139-161, Mass spectrometry in combinatorial chemistry.
[4] G. Subra, L. Soulère, P. Hoffmann, C. Enjalbal, J-L. Aubagnac, J. Martinez, QSAR & Comb. Sci., 2003, 22, 646-651, Parallel and mixture combined approach : Rapid cheap synthesis and characterization of a 4096-tripeptides library.
[5] P. Verdié, G. Subra, L. Feliu, P. Sanchez, G. Bergé, G. Garcin, J. Martinez, J. Comb. Chem., 2007, 9, 254-262, On-Line Synthesis of Pseudopeptide Library Incorporating a Benzodiazepinone Turn Mimic : Biological Evaluation on MC1 Receptors.
[6] P. Zajdel, N. Masurier, P. Sanchez, M. Pawlowski, A. Kreiter, G. Nomezine, C. Enjalbal, M. Amblard, J. Martinez, G. Subra, J. Comb. Chem., 2010, 12, 747-753. Recycling the versatile pipecolic linker.
[7] P. Verdié, L. Ronga, M. Cristau, M. Amblard, S. Cantel, C. Enjalbal, K. Puget, J. Martinez, G. Subra. Chemistry-an Asian Journal, 2011, 6, 2382-2389. Oxyfold : A Simple and Efficient Solid-Supported Reagent for Disulfide Bond Formation.

Analyse de peptides

L’Institut des Biomolécules Max Mousseron possède une expertise en chimie des peptides qui nous permet de disposer d’une collection de séquences modèles à des fins analytiques. Le comportement des peptides en phase gazeuse et leurs mécanismes de fragmentation constituent des thématiques de recherche pérennes dans l’équipe de recherche.

Appareillages :
LC/MS analytique (ZQ,Waters), LC/MS préparative (Système Autopurification, Waters), LC/MS/MS avec configuration QqQ (Quatro Micro, Waters) et QqTof (QTof 1, Waters), MALDI-TOF/TOF (Ultraflex, Bruker).

Collaboration :
G. Subra de l’équipe 9 de l’IBMM « Chimie des Acides Aminés, Peptides, Hétérocycles, Chimie Supportée ».

Publications :
[1] D. Maux, C. Enjalbal, J. Martinez, J-L. Aubagnac, Rapid Commun. Mass Spectrom., 2002, 16, 1470-1475, New example of a proline-induced fragmentation in ESI mass spectrometry of peptides.
[2] L. Mouls, G. Subra, C. Enjalbal, J. Martinez, J-L. Aubagnac, Tetrahedron Lett., 2004, 45, 1173-1178, O-N-Acyl migration in N-terminal serine containing peptides : mass spectrometric elucidation and subsequent development of site-directed acylation protocols.
[3] L. Mouls, G. Subra, J-L. Aubagnac, J. Martinez, C. Enjalbal, J. Mass Spectrom., 2006, 41, 1470-1483, Tandem mass spectrometry of amidated peptides.
[4] L. Mouls, J-L. Aubagnac, J. Martinez, C. Enjalbal, J. Prot. Res., 2007, 6, 1378-1391, Low energy Peptide fragmentations on an ESI-Q-Tof type mass spectrometer.
[5] N. Shenar, N. Sommerer, J. Martinez, C. Enjalbal, J. Mass Spectrom., 2009, 44, 621-632, Comparison of LID versus CID activation modes in tandem mass spectrometry of peptides.
[6] M. Dupré, S. Cantel, P. Verdié, J. Martinez, C. Enjalbal, J. Am. Soc. Mass Spectrom., 2011, 22, 265-279, Sequencing Lys-N Proteolytic Peptides by ESI and MALDI Tandem Mass Spectrometry.
[7] P. Zajdel, C. Enjalbal, M. Zylewski, G. Subra, Int. J. Pept. Res. Ther., 2011, 17, 93-100, On the Manner of Cyclization of N-Acylated Aspartic and Glutamic Acid Derivatives.
[8] M. Dupré, S. Cantel, J. Martinez, C. Enjalbal, J. Am. Soc. Mass Spectrom., 2012, 23, 330-346, Occurrence of C-terminal residue exclusion in peptide fragmentation by ESI and MALDI Tandem Mass Spectrometry.

Analyse de surfaces et imagerie

Parallèlement à la démarche classique d’analyse à haut débit de produits en solution par spectrométries de masse ESI et MALDI, la caractérisation par spectrométrie de masse de molécules ancrées sur support polymérique lors de synthèses en phase solide impose des contraintes spécifiques. En effet, le contrôle analytique doit être non destructif et direct (sans décrocher le produit du support polymérique) afin de suivre in situ et pas à pas les réactions. A côté des réactions classiques impliquées dans la formation d’ions en phase gazeuse telles que les réactions d’oxydo-réduction et les réactions acido-basiques, le paramètre de solubilité (ou d’insolubilité) de l’échantillon s’avère crucial. Ainsi, dans le cas de synthèses en phase solide, le recours à un matériau insoluble nécessite l’emploi d’une technique d’ionisation permettant l’analyse de surfaces. En effet, toutes les techniques de spectrométrie de masse utilisées en chimie et en biologie (communément ESI et MALDI) nécessitent au préalable la solubilisation de l’échantillon. La technique S-SIMS (Secondary Ion Mass Spectrometry) qui implique la désorption d’ions à partir d’un échantillon solide nous a permis d’aborder le problème de l’insolubilité en synthèse organique et d’élargir ainsi la palette du contrôle analytique à l’analyse de surfaces. Cette technique d’ionisation par désorption, antérieure aux techniques FAB et MALDI, permet d’éjecter des ions en phase gazeuse sous l’effet du bombardement énergétique de la surface de l’échantillon. Alors que les techniques FAB et MALDI utilisent des molécules organiques, les matrices, pour assister le processus d’ionisation (matrice liquide pour le FAB et solide pour le MALDI), la technique SIMS ne nécessite aucun traitement de l’échantillon ni aucun adjuvant d’ionisation. L’analyse directe de solide est ainsi possible. La puissance du bombardement que subit l’échantillon est ajustée pour caractériser une zone en surface (régime statique, S-SIMS) ou effectuer une analyse en profondeur (régime profilage). Nous avons mis en œuvre, en collaboration avec Mr R. Combarieu de l’Ecole des Mines de Paris, la technique S-SIMS pour caractériser des échantillons issus de synthèses en phase solide sur résines et sur supports pelliculaires. La cartographie de l’échantillon est accessible en mode imagerie permettant ainsi en une seule acquisition de caractériser des mélanges issus de chimie combinatoire (bibliothèques Mix and Split) ou créés artificiellement par regroupement d’échantillons pour accélérer le contrôle analytique. Il est à noter que l’imagerie en spectrométrie de masse (techniques S-SIMS et MALDI) se développe actuellement à l’interface chimie-biologie comme un nouvel outil d’imagerie biologique.

Appareillage :
Tof-SIMS localisée à l’Ecole des Mines (Sophia Antipolis, France)

Collaborations :
Robert COMBARIEU de l’Ecole des Mines (Sophia Antipolis).

Publications :
[1] J-L. Aubagnac, C. Enjalbal, G. Subra, A.M. Bray, R. Combarieu, J. Martinez, J. Mass Spectrom., 1998, 33, 1094-1103, Application of time-of-flight secondary ion mass spectrometry to in situ monitoring of solid phase peptide synthesis on the MultipinTM system.
[2] C. Enjalbal, J. Martinez, G. Subra, R. Combarieu, J-L. Aubagnac, Rapid Commun. Mass Spectrom., 1998, 12, 1715-1720, Time-of-flight Secondary Ion Mass Spectrometry of Fmoc-amino Acids Linked to Solid Supports Through Ionic Interactions.
[3] J-L. Aubagnac, C. Enjalbal, C. Drouot, R. Combarieu, J. Martinez, J. Mass Spectrom., 1999, 34, 749-754, Imaging Time-of-flight Secondary Ion Mass Spectrometry of Solid-phase Peptide Syntheses
[4] C. Enjalbal, D. Maux, G. Subra, J. Martinez, R. Combarieu, J-L. Aubagnac, Tetrahedron Lett., 1999, 40, 6217-6220, Monitoring and quantification on solid support of a by-product formation during peptide synthesis by Tof-SIMS.
[5] C. Enjalbal, D. Maux, J. Martinez, R. Combarieu, J-L. Aubagnac, Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening, 2001, 4, 363-373, Mass Spectrometry and Combinatorial Chemistry : New approaches for direct support-bound compound identification.
[6] D. Maux, C. Enjalbal, J. Martinez, J-L. Aubagnac, R. Combarieu, J. Am. Soc. Mass Spectrom., 2001, 12, 1099-1105, Static Secondary Ion Mass Spectrometry to monitor solid-phase peptide synthesis.
[7] C. Enjalbal, D. Maux, R. Combarieu, J. Martinez, J-L. Aubagnac, J. Comb. Chem., 2003, 5, 102-109, Imaging combinatorial libraries by mass spectrometry : from Peptide to organic-supported syntheses.

Analyse de polymères et automatisation

Rendre compte du comportement d’un composé en spectrométrie de masse implique que les phénomènes de la chimie (réactions acido-basiques, réactions d’oxydo-réduction et propriétés de solubilisation) soient pris en considération. Alors que les techniques d’ionisation douce telle que ESI, FAB et MALDI se basent principalement sur des phénomènes acido-basiques afin de produire des espèces protonés ou déprotonés, les réactions d’oxydo-réduction ont aussi été mises en évidence, en particulier en spectrométrie de masse FAB. Par contre, la problématique de la solubilité des composés à analyser ne se pose pas tant que l’on considère des molécules de faibles poids moléculaires ou des biomolécules, celles-ci étant, de par leur nature, toujours solubles dans des solvants protiques. Néanmoins, l’élargissement des domaines d’application de la spectrométrie de masse à tout type de composés, incluant les polymères synthétiques de hauts poids moléculaires, nécessite de considérer ce paramètre solubilité/insolubilité. Nous nous sommes intéressés dans le cadre des synthèses effectuées à l’UMR 5247 à cette problématique. Dans le cadre de synthèses sur support polymérique, la modulation de la solubilité par l’utilisation de polymères à solubilité variable de type polyéthylène glycol (PEG) permet de basculer à façon d’une phase homogène (solubilisation) à une phase hétérogène (précipitation). Ainsi, les synthèses en phase liquide, développées comme alternative aux synthèses en phase solide, permettent d’utiliser toutes les techniques usuelles d’analyse de polymères (spectrométries de masse ESI et MALDI). Les molécules en croissance greffées sur le squelette polymérique connu (PEG) constituent le groupe terminal à identifier. Afin de satisfaire les contraintes de haut débit, l’acquisition et l’interprétation des données ont été automatisées.

Appareillages :
LC/MS analytique (ZQ,Waters), LC/MS/MS avec configuration QqQ (Quatro Micro, Waters) et QqTof (QTof 1, Waters), MALDI-TOF/TOF (Ultraflex, Bruker).

Collaboration :
F. Lamaty de l’équipe 11 de l’IBMM « Chimie Verte & Technologies Innovantes ».

Publications :
[1] F. Nativel, C. Enjalbal, F. Lamaty, R. Lazaro, J. Martinez, J-L. Aubagnac, Eur. Mass Spectrom., 1998, 4, 233-237, Electrospray mass spectrometry analysis of liquid-phase organic synthesis.
[2] B. Sauvagnat, C. Enjalbal, F. Lamaty, R. Lazaro, J. Martinez, J-L. Aubagnac, Rapid Commun. Mass Spectrom., 1998, 12, 1034-1037, Step-by step monitoring of a liquid phase organic synthesis by electrospray mass spectrometry.
[3] C. Enjalbal, B. Sauvagnat, F. Lamaty, R. Lazaro, J. Martinez, P. Mouchet, F. Roux, J-L. Aubagnac, Rapid Commun. Mass Spectrom., 1999, 13, 1775–1781, Chemical reactivity in Matrix-assisted Laser Desorption / Ionization Mass Spectrometry.
[4] S. Varray, J-L. Aubagnac, F. Lamaty, R. Lazaro, J. Martinez, C. Enjalbal, European Journal of Analytical Chemistry, 2000, 28, 263-268, Poly(ethyleneglycol) in ESI mass spectrometry.
[5] C. Enjalbal, F. Lamaty, P. Sanchez, E. Suberchicot, P. Ribière, S. Varray, R. Lazaro, N. Yadav-Bhatnagar, J. Martinez, J-L. Aubagnac, Anal. Chem., 2003, 75, 175-184, Characterization of soluble polymer supported organic compounds by LC/Electrospray ionization MS towards a complete automation of the liquid-phase process in combinatorial chemistry.
[6] C. Enjalbal, P. Ribière, F. Lamaty, N. Yadav-Bhatnagar, J. Martinez, J-L. Aubagnac, J. Am. Soc. Mass Spectrom., 2005, 16, 670-678, MALDI-TOF MS analysis of soluble PEG based multi-step synthetic reaction mixtures with automated detection of reaction failure.
[7] F. B. Oliveira, C. Gardrat, C. Enjalbal, E. Frollini, A. Castellan, Journal of Applied Polymer Science, 2008, 109, 2291-2303, Phenol-furfural resins to elaborate composites reinforced with sisal fibers- Molecular analysis of resin and properties of composites.

Marquage isotopique et dosage en milieu biologique

Tout contrôle analytique implique non seulement de détecter et identifier les composés présents dans un mélange complexe mais aussi de les doser. La spectrométrie de masse couplée à une technique séparative (LC/ESI-MS) et le recours au marquage isotopique satisfont les contraintes d’un tel contrôle en matière de sensibilité, spécificité, durée d’enregistrement et traitement des données.

Appareillages :
LC/MS analytique (ZQ,Waters), LC/MS/MS avec configuration QqQ (Quatro Micro, Waters) et QqTof (QTof 1, Waters), MALDI-TOF/TOF (Ultraflex, Bruker).

Collaborations :
F. Bressolle de la Faculté de pharmacie de Montpellier et H. Vial de l’Université Montpellier 2.

Publications :
[1] C. Farenc, C. Enjalbal, P. Sanchez, F. Bressolle, M. Audran, J. Martinez, J-L. Aubagnac, J. Chromatogr. A, 2001, 910, 61-67, Quantitative determination of rocuronium in human plasma by liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry.
[2] C. Enjalbal, R. Roggero, R. Cerdan, J. Martinez, H. Vial, J-L. Aubagnac, Anal. Chem. 2004, 76, 4515-4521, Automated monitoring of phosphatidylcholine biosyntheses in Plasmodium falciparum by electrospray ionization mass spectrometry through stable isotope labeling experiments.
[3] D. Paramelle, G. Subra, L. Vezenkov, M. Meynadier, C. André, C. Enjalbal, M. Calmès, M. Garcia, J. Martinez, M. Amblard, Angew. Chem. Int. Ed., 2010, 49, 8240-8243. A straightforward approach for cellular-uptake quantification.

Séquençage peptidique

En protéomique selon une stratégie « bottom-up », les identifications de protéines reposent sur la caractérisation par spectrométrie de masse de séquences peptidiques issues de digestion enzymatique (trypsine, Lys-N, Glu-C, …). Pour ce faire, chaque protéine isolée par diverses techniques séparatives est tout d’abord soumise à une digestion enzymatique ; le mélange de peptides ainsi obtenu est analysé par spectrométrie de masse MALDI (cartographie peptidique massique) et par spectrométrie de masse ESI en tandem (LC/ESI-MS/MS) afin de générer des informations de séquence. Les stratégies type « shotgun » reposent uniquement sur l’acquisition de données en LC/MS/MS à partir de la digetsion de la globalité de l’échantillon protéique. Les résultats obtenus sont ensuite confrontés aux séquences de protéines connues archivées dans diverses bases de données. L’étape de séquençage peptidique s’avère ainsi cruciale et repose sur l’acquisition de spectres MS/MS de qualité ainsi que sur une connaissance approfondie des mécanismes de dissociation en phase gazeuse des peptides. Nous avons donc apporté notre contribution à l’élaboration de modèles de fragmentation de peptides dans des conditions de dissociations basses et hautes énergies induites par collision (instruments de type QqQ, Trappe d’ions, QqTof couplés à une source ESI et Tof/Tof couplé à une source MALDI) afin d’améliorer les logiciels d’interprétation automatisée de spectres MS/MS. Les paramètres instrumentaux et structuraux ont été étudiés en se basant sur une approche statistique (étude de plus de 300 peptides synthétiques de séquences variées mimant pour certaines d’entre eux des peptides protéolytiques en ayant fait varier la longueur, composition en acides aminés, modification de chaînes latérales, modification des extrémités N ou C-terminales, …).

Appareillages :
LC/MS/MS avec configuration QqQ (Quatro Micro, Waters) et QqTof (QTof 1, Waters), MALDI-TOF/TOF (Ultraflex, Bruker).

Collaboration :
G. Subra de l’équipe 9 de l’IBMM « Chimie des Acides Aminés, Peptides, Hétérocycles, Chimie Supportée ».
J. Armengaud et A. Dedieu du CEA, Direction des Sciences du Vivant (Marcoule)

Publications :
[1] D. Maux, C. Enjalbal, J. Martinez, J-L. Aubagnac, Rapid Commun. Mass Spectrom., 2002, 16, 1470-1475, New example of a proline-induced fragmentation in ESI mass spectrometry of peptides.
[2] L. Mouls, G. Subra, J-L. Aubagnac, J. Martinez, C. Enjalbal, J. Mass Spectrom., 2006, 41, 1470-1483, Tandem mass spectrometry of amidated peptides.
[3] L. Mouls, J-L. Aubagnac, J. Martinez, C. Enjalbal, J. Prot. Res., 2007, 6, 1378-1391, Low energy Peptide fragmentations on an ESI-Q-Tof type mass spectrometer.
[4] N. Shenar, N. Sommerer, J. Martinez, C. Enjalbal, J. Mass Spectrom., 2009, 44, 621-632, Comparison of LID versus CID activation modes in tandem mass spectrometry of peptides.
[5] M. Baudet, P. Ortet, J-C. Gaillard, B. Fernandez, P. Guérin, C. Enjalbal, G. Subra, A. de Groot, M. Barakat, A. Dedieu, J. Armengaud, Molecular and Cellular Proteomics, 2010, 9, 415-426, Proteomic-based refinement of Deinococcus deserti genome annotation reveals an unwonted use of non-canonical translation initiation codons.
[6] M. Dupré, S. Cantel, P. Verdié, J. Martinez, C. Enjalbal, J. Am. Soc. Mass Spectrom., 2011, 22, 265-279, Sequencing Lys-N Proteolytic Peptides by ESI and MALDI Tandem Mass Spectrometry.
[7] M. Dupré, S. Cantel, J. Martinez, C. Enjalbal, J. Am. Soc. Mass Spectrom., 2012, 23, 330-346, Occurrence of C-terminal residue exclusion in peptide fragmentation by ESI and MALDI Tandem Mass Spectrometry.

LDI-MS sur support inerte

L’émergence de disciplines post-génomiques, telles que la protéomique et la métabolomique, requiert le développement d’outils analytiques toujours plus performants afin de déterminer, respectivement, l’ensemble des protéines et des composés organiques de faible masse moléculaire présents dans un milieu biologique. En raison de sa sensibilité, spécificité, rapidité d’acquisition des données et capacité de couplage avec des techniques séparatives, la spectrométrie de masse constitue une des techniques majeures de ces domaines de recherche visant à la compréhension globale des systèmes vivants.

Différentes techniques de spectrométrie de masse par désorption/ionisation laser (LDI) dites ‘Matrix-free’ ou ‘SALDI’ pour Surface-Assisted Laser Desorption Ionization ont été évaluées au laboratoire dans le cadre de la détection de peptides synthétiques disponibles à l’état pur (peptidothèque de plus de 300 séquences de compositions et de taille variées). Divers supports inertes présentant des propriétés physico-chimiques variées, tels que des poudres et des surfaces de natures diverses (métal, carbone, silicium, titane), présentant des architectures désordonnées (poudre amorphe) ou ordonnées (materiaux poreux, nanoparticules, nanotubes, nanofils) ont été étudiés comme adjuvant d’ionisation. La sensibilité et la reproductibilité des analyses ont été comparées montrant des performances intéressantes dans le cas de matériaux structurés à base de silice. Les problématiques de discrimination spectrale dans le cas d’études de mélanges peptidiques ont été abordées afin de valider cette méthodologie d’analyse LDI pour l’acquisition de cartographie peptidique massique en protéomique. Ces études ont été complétées par des expériences de spectrométrie de masse en tandem sur des appareillages de type MALDI-Tof/Tof afin de rationaliser les fragmentations observées selon les modes de dissociation haute énergie CID et LID avec les données de séquençage obtenues en CID basse énergie (ESI-QqTof).

De nouvelles stratégies analytiques basées sur divers types de surfaces inertes utilisées en combinaison avec des adjuvants d’ionisation ont été développées en LDI-MS ainsi qu’en LDI-MS/MS. Des développements méthodologiques seront ensuite mis en œuvre pour élargir et adapter ces techniques de détection et caractérisation de peptides (applications en protéomique) aux petites molécules (applications en métabolomique).

Appareillages :
MALDI-TOF/TOF (Ultraflex, Bruker).

Collaboration :
R. Boukherroub et Y. Coffinier de l’IRI, Université de Lille.
J.O. Durand de l’Institut Charles Gerhardt, Université de Montpellier 2

Publications :
[1] N. Shenar, J. Martinez, C. Enjalbal, J. Am. Soc. Mass Spectrom., 2008, 19, 632-644, Laser Desorption/ionization mass spectrometry on porous silica and alumina for peptide mass fingerprinting.
[2] N. Shenar, S. Cantel, J. Martinez, C. Enjalbal, Rapid Commun. Mass Spectrom., 2009, 23, 2371-2379, Comparison of inert supports in laser desorption/ ionization mass spectrometry of peptides : pencil lead, porous silica gel, DIOS-chip and NALDITM target.
[3] G. Subra, A. Mehdi, C. Enjalbal, M. Amblard, L. Brunel, R. Corriu, J. Martinez, J. Mater. Chem., 2011, 21, 6321-6326, Functionalised mesoporous silica : A good opportunity for controlled peptide oligomerisation.
[4] M. Dupré, Y. Coffinier, R. Boukherroub, S. Cantel, J. Martinez, C. Enjalbal, J. Proteomics, 2012, 75, 1973-1990, Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry of protein digests on nanostructured silicon plates.

Sulfoprotéome

L’étude des systèmes vivants a été révolutionnée par l’explosion des informations génétiques. Il est maintenant établi que la structure d’une protéine mature n’est pas uniquement dépendante de son gène. Les modifications post-traductionnelles (MPT) sont des évènements covalents qui modifient les propriétés physico-chimique d’une protéine : activité, stabilité, interaction protéine-protéine, régulation du cycle cellulaire, transport membranaire, ou encore l’adhésion cellulaire. Il est maintenant établi que la régulation des MPT est pertubée dans plusieurs formes de cancer humain. La caractérisation des MPT représente donc un des axes de recherche majeurs de l’ère post-génomique et ce tant sur le plan diagnostic que pronostic. Parmi les 250 MPT répertoriées, deux d’entre elles sont plus particulièrement importantes : la phosphorylation et la sulfatation. La phosphorylation et la sulfatation sont des MPT importantes qui affectent les fonctions de nombreuses molécules biologiques, telles que les glucides, les dérivés glycosylés et les protéines. Les acides aminés les plus sensibles à ces deux MPT sont la tyrosine, la sérine, et la thréonine. Par ailleurs elles ajoutent toute deux une masse de 80 u à l’acide aminé qui les porte rendant ainsi très difficile leur différenciation. Ces deux MPT sont associées à différentes fonctions biologiques, et le développement de méthodes efficaces et sensibles pour la discrimination de ces structures est essentiel à la compréhension de leurs rôles et fonctions dans les processus biologiques. La spectrométrie de masse est reconnue à ce jour être un outil très puissant pour la caractérisation de ces MPT. La problématique est que les peptides sulfatés sont difficilement détectables du fait de la liaison sulfo-ester qui devient très labile durant les analyses par spectrométrie de masse induisant une perte de l’information. La caractérisation des MPT représente un des axes de recherche majeurs de l’ère post-génomique et ce tant sur le plan diagnostic que pronostic. La phosphorylation et la sulfatation sont des MPT importantes qui affectent les fonctions de nombreuses molécules biologiques. La spectrométrie de masse est reconnue à ce jour être un outil très puissant pour la caractérisation de ces MPT.

Une approche originale permet d’effectuer un étiquetage chimique non-covalent sélectif de résidus présentant une modification post-traductionnelle (MPT) permettant une détection efficace en MALDI-MS en mode réflectron positif conduisant à l’identification spécifique et la caractérisation de ces peptides au sein de mélanges complexes de peptides après hydrolyse des protéines. Nous avons développé une méthodologie permettant la détection de sulfopeptides à travers la formation de complexes non-covalents entre une petite molécule et le peptide sulfaté. L’utilisation de cet agent efficace de dérivatisation a permis la détection directe, spécifique, la détermination du poids moléculaire et le degré de sulfatation des sulfopeptides dans une expérience unique. Alors que toutes les techniques d’analyse de peptides régulièrement effectuées en mode positif ne permettent pas la détection des peptides contenant des liens labiles sulfo-ester, nos résultats fournissent une solution simple pour l’analyse des peptides sulfo-modifiés. Hautement discriminante par rapport aux phosphopeptides, la méthodologie décrite ici saura sans aucun doute contribuer à l’exploration du sulfoproteome. Nous proposons un profil MS/MS général permettant une discrimination simple et rapide entre peptides sulfatés et non sulfatés.

Appareillages :
MALDI-TOF/TOF (Ultraflex, Bruker).

Collaboration :
M. Smietana de l’équipe 3 de l’IBMM « Oligonucléotides Modifiés ».

Publication :
[1] une publication soumise

Biomarqueurs de protéines

Le criblage pharmacologique à haut débit (HTS) s’est imposé comme un outil majeur dans la recherche et l’optimisation de molécules bioactives à visée thérapeutique. Toutefois, la mesure d’interaction entre un récepteur et un ligand nécessite des moyens de détection et de quantification puissants (Ki<10-8M). La spectrométrie de masse est une piste particulièrement intéressante dans l’exploration de cette problématique. En effet, cette technique est remarquable pour sa spécificité et sa sensibilité permettant la détection, l’identification et la quantification de biomolécules ou d’éléments chimiques dans des milieux complexes. Une première stratégie consiste en la conception et synthèse de nouveaux marqueurs chimiques universels qui pourront être liés à de multiples ligands de référence. Ces marqueurs devront favoriser la détection des molécules d’intérêt et permettre leur quantification par marquage isotopique où la quantification se fait par introduction dans le milieu biologique de la molécule à doser contenant des isotopes stables lourds (D, 13C). Ces méthodes seront mises en œuvre, dans le cadre de diverses problématiques biologiques (interaction protéine/ligand, dosage de CCP pour Cell Penetrating Peptides, …). D’un point de vue méthodologique, ce projet fait intervenir la synthèse de nouveaux marqueurs spécifiques. Une mise au point très importante en spectrométrie de masse concernera le traitement d’échantillons biologiques, la détection de signaux spécifiques renseignant la présence de composés ciblés et la quantification de ces composés au sein d’un mélange.

Appareillages :
MALDI-TOF/TOF (Ultraflex, Bruker).

Collaborations :
M. Amblard, G. Subra et N. Masurier de l’équipe 9 de l’IBMM « Chimie des Acides Aminés, Peptides, Hétérocycles, Chimie Supportée ».

Publications :
[1] D. Paramelle, S. Cantel, C. Enjalbal, M. Amblard, E. Forest, M. Heymann, C. Geourjon, J. Martinez, G. Subra, Proteomics, 2009, 9, 5384-5388, A new generation of cross-linkers for selective detection by MALDI MS.
[2] D. Paramelle, G. Subra, L. Vezenkov, M. Meynadier, C. André, C. Enjalbal, M. Calmès, M. Garcia, J. Martinez, M. Amblard, Angew. Chem. Int. Ed., 2010, 49, 8240-8243, A straightforward approach for cellular-uptake quantification.
[3] D. Paramelle, C. Enjalbal, M. Amblard, E. Forest, M. Heymann, S. Cantel, C. Geourjon, J. Martinez, G. Subra, Proteomics, 2011, 11, 1277-1282, Solid-Phase Cross-Linking (SPCL) : A new tool for protein structure studies.

Criblage de fragments

Le criblage biologique à haut débit (high throughput screening, HTS) de chimiothèques de synthèse ou de produits naturels s’est imposé comme un outil majeur dans la recherche de touches mais aussi dans l’optimisation de têtes de série pour la mise au point de molécules à visée thérapeutique. L’utilisation de la stratégie de découverte nouveaux candidats-médicaments dans l’industrie pharmaceutique par criblage de molécules dites ‘fragments’ a conduit, avec succès, à l’identification de nouvelles têtes de séries pour plusieurs cibles protéiques. Cette stratégie combine la chemo-informatique, les criblages expérimentaux et la chimie médicinale. La spectrométrie de masse peut fournir une piste particulièrement intéressante dans l’exploration de cette problématique bien que la méthodologie développée repose sur l’interaction entre un ligand potentiel et son récepteur en phase gazeuse. La difficulté réside donc dans l’optimisation de certaines conditions d’analyse afin de garder l’intégrité de l’interaction non covalente existante en solution. Par contre, la caractérisation/quantification des interactions protéine-petites molécules à l’aide de la spectrométrie de masse présente certains avantages par rapport aux autres technologies en raison notamment de sa grande sensibilité. Le criblage de molécules d’intérêt thérapeutiques grâce à cette technique permettra donc la mise en évidence d’interaction entre un ligand et la protéine cible ainsi que de confirmer la spécificité de ce ligand.

Trouver des stratégies appropriées permettant de conserver et de détecter ces interactions non-covalentes, faire la distinction entre des complexes spécifiques et non spécifiques et évaluer la différence de comportement entre la phase gazeuse et la solution sont les principaux défis de l’analyse des complexes non-covalents par spectrométrie de masse.

Appareillage :
MALDI-TOF/TOF (Ultraflex, Bruker).

Collaboration :
Ce projet s’effectue en coopération avec Le Centre de Biochimie Structurale de Montpellier
(CBS).
Dr J.F. Guichou, de l’Equipe « Criblages et Conception Rationnelle de Molécules
Thérapeutiques, et Cristallographie » est responsable de la Conception de molécules d’intérêt
biologique et de la Recherche in silico à partir des chimiothèques disponibles au sein de son équipe.
Ce travail a été débuté lors du stage post-doctoral de Dr Eva Balentova (Oct. 2009-Sept.2010)

Publication :
1 brevet en cours de dépôt.

ECOLOGIE CHIMIQUE.

S. DUTERTRE
Tel : 04 67 14 38 09
Email : Sebastien.Dutertre univ-montp2.fr

1. Axes de recherche

Sans en avoir forcément conscience, nous sommes constamment en contact avec des molécules issues de notre environnement, simplement au travers de l’air que nous respirons, la nourriture que nous absorbons, ou l’eau que nous buvons. Ces petites entités chimiques peuvent interagir avec nos propres cellules et nos récepteurs, influant sur notre comportement ou nous rendant malades. Les plantes, les microbes et les animaux ont exploité ce monde invisible « de l’écologie chimique » pour favoriser leur survie ou faciliter la rencontre avec un partenaire sexuel pour augmenter le taux de reproduction de leur espèce. Parmi les exemples les plus frappants d’interactions chimiques ciblées, les animaux venimeux ont développé des molécules remarquables (les « toxines ») au cours de leur évolution afin de faciliter la capture de leur proies et pour se défendre contre les prédateurs.

Photo : Eric Le Court de Billot.

Mes travaux de recherche s’appliquent a analyser la complexité des venins et comprendre le mode d’action des toxines au niveau moléculaire et évaluer leur potentiel thérapeutique, ainsi que de déterminer leur rôle dans l’évolution des espèces. Des études moléculaires et phylogénétiques ont montré que l’évolution des stratégies d’envenimation est typiquement une adaptation pour faciliter la prédation plutôt qu’une adaptation défensive, malgré l’importance de la défense pour la survie animale. Cependant, nous avons démontré récemment que l’utilisation défensive du venin chez les mollusques venimeux prédateurs du genre Conus pourrait être un moteur important de spéciation. En effet, nos données suggèrent que les toxines de défense initialement développées chez les cônes ancestraux vermivores pour se protéger contre les poissons et les céphalopodes prédateurs ont facilité la transition d’un régime vermivore vers des régimes mallacophages et piscivores.

Les venins animaux sont très prometteurs pour la découverte de nouveaux agents thérapeutiques, mais démêler leur pharmacologie complexe et isoler les composants actifs individuels mineurs parmi les centaines présents dans un seul venin est une tache très difficile. Chacune de ces “toxines” cible potentiellement un des canaux ioniques ou d’autres récepteurs membranaires essentiels avec une affinité et une sélectivité remarquable, le défi étant de trouver sa cible. Un nombre impressionnant de cibles pharmacologiques ont déjà été identifiées, mais d’autres sont encore susceptibles d’être découvertes à l’avenir. En effet, le venin est constitué de centaines de petits peptides, souvent riches en ponts disulfures, ainsi que de nombreuses protéines, acides aminés et autres petites molécules. Avec par exemple plus de 40.000 espèces d’araignées et 10.000 espèces de mollusques venimeux, les venins forment une bibliothèque naturelle de millions de composés bioactifs. On estime que pour les cônes seuls, moins de 2% de la diversité de leur venin a été découvert, et moins de 1% a été caractérisé pharmacologiquement.

La spectrométrie de masse est devenue la méthode de choix pour étudier la complexité des venins. En particulier, les technologies d’ionisation douces comme le MALDI et l’électrospray ( ESI ) sont fortement utilisés pour démêler la composition de ces mélanges protéiques. Alors que les venins peuvent être étudiées dans leur ensemble (fingerprinting, distribution de masse…etc), ils sont généralement pré-fractionné pour une meilleure résolution, et pour réduire l’effet de la suppression d’ions. Une étape de chromatographie en phase liquide peut être effectuée hors ligne (MALDI ) ou en ligne (ESI), chaque méthode offrant des prestations de haute qualité avec des ensembles de données complémentaires. Les récentes améliorations de la sensibilité (plage dynamique) et la précision des spectromètres de masse permettent une analyse à haut débit à partir de très petits échantillons. Par exemple , en utilisant un Orbitrap - ETD combinée avec une stratégie de dérivation chimique spécifique, les séquences complètes de 31 toxines peptidiques ont pu être obtenues à partir de seulement 7 % du venin brut d’un seul Conus textile (Ueberheide et al., PNAS, 2009).

Intégration de data transcriptomiques-protéomiques

Le projet du génome humain, avec son exigence de débit sans précédent pour le séquençage de l’ADN, a stimulé le développement de nouvelles technologies qui peuvent maintenant bénéficier a de nombreux projets de recherche, y compris ceux portant sur les organismes non-modèles tels que les animaux venimeux. Les technologies dites « de nouvelle génération », par opposition au séquençage Sanger traditionnel, permettent ainsi des réalisations scientifiques remarquables et des applications biologiques nouvelles. Ces technologies de séquençage de nouvelle génération ne sont pas limitées à des projets de génomique, et elles sont particulièrement pertinentes pour les projets de découverte a partir de venin. L’analyse du transcriptome de la glande a venin permet de révéler toutes les séquences de toxines en une seule expérience. Malheureusement, la forte prévalence des modifications post-traductionnelles dans beaucoup de toxines empêchent un processus de découverte base sur les données transcriptomiques seules, et l’intégration de données protéomique est nécessaire. Couplé à des systèmes de criblages a haut débit miniaturisés, ces approches intégrées vont augmenter le taux de découverte a partir de cette précieuse ressource que sont les venins.

2. Publications (sélection)

Akondi KB, Muttenthaler M, Dutertre S, Lewis RJ, Craik DJ and Alewood PF (2014). Conotoxins : Advancing towards peptide therapeutics.
Chemical Reviews, accepted manuscript. IF 2012= 41.298.

Dutertre S, Jin AH, Vetter I, Hamilton B, Sunagar K, Lavergne V, Dutertre V, Fry BG, Antunes A, Venter DJ, Alewood PF and Lewis RJ (2014). Evolution of separate predation- and defence-evoked venoms in carnivorous cone snails.
Nature Communications, accepted manuscript. IF 2012= 10.015.

Dutertre S*, Jin AH*, Kaas Q, Jones A, Alewood PF and Lewis RJ (2013). Deep venomics reveals the mechanism for expanded peptide diversity in cone snail venom. *Contributed equally.
Molecular & Cellular Proteomics, 12 : 312-329. IF 2012= 7.251.

Lewis RJ, Dutertre S, Vetter I and Christie MJ (2012). Conus venom peptide pharmacology.
Phamacological Reviews, 64:259-298. IF 2012= 22.345.

Dutertre S and Lewis RJ (2010). Use of venom peptides to probe ion channel structure and function.
Journal of Biological Chemistry, 285:13315-13320. IF 2012= 4.651.

Dutertre S, Crocker D, Daly N, Andersson A, Muttenthaler M, Lumsden NG, Craik DJ, Alewood PF, Guillon G and Lewis RJ (2008). Conopressin-T from Conus tulipa reveals an antagonist switch in vasopressin-like peptides.
Journal of Biological Chemistry, 283:7100-7108. IF 2012= 4.651.

Dutertre S, Ulens C, Buttner R, Fish A, Van Elke R, Kendel Y, Hopping G, Alewood PF, Schroeder CI, Nicke A, Smit AB, Sixma TK and Lewis RJ (2007). Novel AChBP-targeted α-conotoxin correlates distinct binding orientations with nAChR subtype-selectivity.
EMBO Journal, 26:3858-3867. IF 2012= 9.822.

Voir en ligne : L’équipe Analyses Biomolécules

Portfolio